Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi

Halo sobat lab, bagaimana kabarnya hari ini? Semoga dalam keadaan sehat semua ya. Sobat Lab pasti sudah tahu mengenai HPLC bukan? Nah pada artikel kali ini penulis memiliki artikel yang berjudul : “Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi“. Semoga bisa bermanfaat dan bisa menambah ilmu pengetahuan kita semua.

validasi-metode-hplc-untuk-analisis-farmasi-distributor-alat-laboratorium-andaru
Gambar Ilustrasi Validasi Metode HPLC untuk Analisis Farmasi

PT. Andaru Persada Mandiri adalah distributor alat laboratorium yang memberikan solusi lengkap layanan terintegrasi. Andaru menjual berbagai alat laboratorium, memberikan layanan installasi, training pengguna, service, maintenance dan kalibrasi alat laboratorium. Bagi anda yang membutuhkan alat laboratorium bisa menghubungi kami via whatsapp 087777277740 atau telepon 0251-7504679. Yuk kita mulai pembahasannya!

Sekilas Tentang Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi

Validasi prosedur analitik adalah untuk menunjukkan bahwa suatu metode benar dan dapat digunakan secara rutin. Metode uji secara kromatografi memiliki peran penting dalam industri farmasi mulai dari penemuan, pengembangan, formulasi dan kontrol kualitas obat.

Validasi metode membuktikan bahwa metode tersebut memberikan konsistensi serta data yang handal dan akurat. Validasi metode ini membantu analis control kualitas untuk memastikan produk berkualitas dirilis ke pasar.

Parameter untuk validasi metode sesuai dengan pedoman ICH termasuk akurasi, presisi, spesifisitas dan batas deteksi (LOD), batas kuantitas (LOQ), linearitas, jangkauan (range) dan ketahanan (robustness). Dalam industri farmasi, Validasi metode uji yang menggunakan HPLC merupakan bagian penting dari kontrol kualitas dan jaminan mutu.

Pengertian Kromatografi

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur dimana zat terlarut dipisahkan oleh diferensial dinamis proses migrasi dalam suatu sistem yang terdiri dari dua atau lebih fase gerak, salah satunya bergerak terus menerus dalam arah tertentu dan di mana masing-masing zat menunjukkan perbedaan polaritas karena perbedaan dalam penyerapan, partisi, kelarutan, tekanan uap, molekuler ukuran atau kerapatan muatan ionic.

HPLC adalah bentuk modern kromatografi cair yang menggunakan kolom partikel kecil yang dilalui fase gerak dipompa dengan tekanan tinggi. Pemisahan komponen tergantung pada sejauh mana interaksi antara komponen terlarut dan fase diam. Komponen yang memiliki afinitas terendah untuk fase diam akan terelusi terlebih dahulu. HPLC menjadi metode analisis yang disukai di antara berbagai metode analisis farmasi. Dalam uji HPLC, jika fase gerak yang digunakan adalah cairan non-polar maka jenis kolom kromatografinya polar disebut HPLC normal phase. Namun, jika dalam HPLC fase gerak yang digunakan adalah cairan polar maka jenis kolom kromatografinya non-polar disebut HPLC reverse phase.

Baca juga : promo alat laboratorium

Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi

Metode HPLC yang akan digunakan secara rutin harus mampu melakukan analisis yang cepat, sensitivitas yang baik, resolusi tinggi, pengambilan sampel mudah, hasil uji akurasi serta presisi dan memberikan hasil reproducibility yang baik.

Acuan validasi metode HPLC dalam US Pharmacopoeia tercantum dalam bagian <621> tentang “kromatografi” meliputi HPLC sehingga dapat dipelajari dan dimodifikasi. ICH menerbitkan dua pedoman metode validasi. Q2A menjelaskan terminologi dan definisi untuk berbagai parameter dipertimbangkan untuk validasi. Q2B memberikan deskripsi metode yang akan digunakan untuk memperkirakan karakteristik validasi. Ini juga memberikan fleksibilitas dalam prosedur.

Langkah-langkah validasi metode berdasarkan acuan tersebut adalah sebagai berikut :

Kembangkan protokol validasi atau prosedur operasi untuk validasi metode uji HPLC

  1. Tentukan analit yang akan di analisis dalam suatu sampel secara HPLC
  2. Tentukan aplikasi, tujuan dan ruang lingkup metode uji analit tersebut secara HPLC
  3. Tentukan parameter kinerja dan kriteria penerimaan syarat mutu uji secara HPLC
  4. Tentukan eksperimen validasi uji secara HPLC
  5. Verifikasi karakteristik kinerja peralatan yang relevan untuk dilakukan validasi metode HPLC
  6. Bahan berkualitas, misalnya baku standar dan reagen
  7. Lakukan eksperimen pra-validasi / method development / trial
  8. Sesuaikan parameter metode dan kriteria penerimaan syarat mutu uji secara HPLC jika perlu
  9. Lakukan percobaan validasi penuh uji secara HPLC
  10. Mengembangkan SOP untuk melaksanakan metode secara rutin
  11. Tentukan kriteria untuk validasi ulang uji secara HPLC
  12. Menentukan jenis dan frekuensi pengujian kesesuaian sistem untuk rutin
  13. Lakukan pemeriksaan dokumen percobaan dan hasil validasi.

Karakteristik Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi

Karakteristik yang perlu divalidasi untuk berbagai jenis metode termasuk uji secara HPLC juga disebutkan dalam pedoman ICH. Berikut karakteristik yang perlu divalidasi (tabel 1).

Tabel 1 Parameter validasi metode berdasarkan ICH guideliness

Characteristics

Identification

Test for Impurities

Assay

Quantitative

Limit Test

Accuracy

X

X

Precision
Repeatability

X

X

Intermediate Precision

X

X

Specificity

Detection Limit

X

X

X

Quantitation Limit

X

X

X

Linearity

X

X

Range

X

X

Ket : √ menunjukkan ini perlu dilakukan dalam uji validasi ; X menunjukkan ini tidak perlu dilakukan dalam uji validasi

Jika pedoman validasi berdasarkan United State Pharmacopoeia (USP), klasifikasi parameter validasi dibagi ke dalam empat kategori dan juga menentukan parameter mana yang harus dipertimbangkan untuk validasi dalam berbagai jenis metode.

  • Kategori I: Metode analitik untuk kuantisasi pengukuran zat obat curah atau zat aktif bahan termasuk bahan pengawet dalam produk farmasi jadi.
  • Kategori II: Metode analitis untuk penentuan ketidakmurnian dalam obat ruahan atau untuk penentuan senyawa degradasi dalam produk farmasi jadi.
  • Kategori III: Metode analitis untuk menentukan karakteristik kinerja (mis.disolusi, pelepasan obat).
  • Kategori IV: Uji identifikasi.

Tabel 2 Parameter yang diperlukan untuk validasi sesuai USP

Analytical Performance Characteristics

Category I

Category II

Category III

Category IV

Quantitative

Limit Test

Accuracy

*

*

Precision

Specificity

*

Limit of Detection

*

Limit of Quantitation

*

Linearity

*

Range

*

*

Ruggedness

Ket : √ menunjukkan parameter yang perlu dilakukan dalam uji validasi ; * menunjukkan parameter dapat dipertimbangkan tergantung pada sifat pengujian yang dilakukan dalam uji validasi

Baca juga : metode uji alternatif spektrofotometer untuk kosmetik lipstik

Sebagai detil dari parameter USP untuk validasi , parameter yang perlu dilakukan sesuai dengan persyaratan dalam validasi metode HPLC dibahas di bawah ini.

2.1. Selektivitas dan Spesifisitas Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi

Selektivitas metode analitik didefinisikan sebagai sejauh mana metode dapat mengukur analit di hadapan inerferen. Komponen lain yang mungkin ada termasuk pengotor, degradasi, matriks, dll. Istilah spesifisitas dan selektivitas sering digunakan bergantian. Istilah spesifik umumnya mengacu pada metode yang menghasilkan respons untuk analit tunggal saja, sedangkan istilah selektif mengacu pada metode yang memberikan tanggapan untuk jumlah entitas kimia yang mungkin atau mungkin tidak dapat dibedakan satu sama lain.

Selektivitas dari metode kromatografi dapat dinilai dengan pemeriksaan homogenitas puncak atau kemurnian puncak uji dari hasil analisis HPLC. Uji kemurnian puncak menunjukkan bahwa tidak ada ko-elusi dari setiap komponen sampel. Untuk ini, puncak penilaian kemurnian dilakukan dengan HPLC menggunakan detektor PDA atau MS.

2.2. Linearitas

Linearitas suatu metode untuk memperoleh hasil pengujian yang berbanding lurus dengan konsentrasi pada rentang konsentrasi tertentu. Untuk metode HPLC, hubungan linear antara detector respon (area puncak dan tinggi) dan konsentrasi sampel berbanding lurus dan sangat menentukan keberhasilan analisis dalam HPLC dalam berbagai rentang konsentrasi sampel. Hubungannya bisa ditunjukkan langsung pada bahan obat dengan pengenceran stok standar atau dengan penimbangan terpisah
sampel komponen.

Linearitas harus dievaluasi dengan inspeksi visual dari sebidang sinyal sebagai fungsi analit konsentrasi atau isi. Jika ada hubungan linier, hasil tes harus dievaluasi oleh metode statistik yang sesuai, misalnya dengan analisis regresi. Data dari garis regresi sangat membantu untuk memberikan perkiraan matematis dari tingkat linearitas. Secara umum dinyatakan dalam hal varians di sekitar kemiringan garis regresi. Yang banyak digunakan rentang linieritas dan kriteria penerimaan untuk berbagai metode farmasi tercantum dalam tabel 3.

Tabel 3 Rentang Linearitas dan Kriteria penerimaan untuk berbagai metode farmasi

Test Linearity Levels and Ranges Acceptance Criteria
Assay Five levels, 50-150% of label claim Correlation coefficient, R ≥ 0.999
Dissolution Five to eight levels, 10-150% of label claim % y intercept NMT 2.0% R ≥ 0.99
Related Substances Five levels, LOQ to acceptance criteria % y intercept NMT 5.0% R ≥ 0.99

2.3. Presisi

Presisi suatu metode analitik untuk menggambarkan hasil uji dengan kedekatan data dalam serangkaian pengukuran diperoleh dari multiple sampling dari sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang ditentukan. Repeatabilility adalah presisi dalam kondisi pengoperasian yang sama dalam interval waktu yang singkat. Disebut sebagai presisi intra-assay. Dilakukan dengan membuat enam sampel pada konsentrasi 100% atau dengan menyiapkan tiga sampel pada tiga konsentrasi dalam rangkap tiga yang mencakup
rentang yang ditentukan untuk prosedur validasi metode HPLC.

Intermediate precision menggambarkan variasi dalam laboratorium: hari yang berbeda, analis yang berbeda, peralatan HPLC yang berbeda, dll. Parameter ini digunakan sebagai penentuan sejauh mana presisi menengah harus ditetapkan tergantung pada keadaan di mana prosedur HPLC tersebut dimaksudkan untuk digunakan.

Reproducibility adalah presisi yang diperoleh dengan analisis antar laboratorium. Secara umum dinilai selama studi kolaboratif untuk transfer metode. Itu dinilai dengan cara dari uji coba antar laboratorium. Data presisi umumnya dinyatakan dalam bentuk standar deviasi, standar relative deviasi dan CV. Untuk memastikan ketepatan metode untuk analit utama, RSD harus ≤ 2%. Untuk impurities tingkat rendah, RSD 5-10% biasanya dapat diterima.

2.4. Range/Rentang

Rentang metode analisis adalah interval antara konsentrasi analit atas dan bawah dalam sampel (yang telah dibuktikan bahwa prosedur analitis HPLC yang sudah dilakukan memiliki tingkat presisi, akurasi dan linearitas yang sesuai. Kisaran range/rentang tersebut biasanya berasal dari studi linearitas dan tergantung pada penerapan prosedur yang diinginkan. Pertimbangan penentuan range/rentang mencakup hal berikut :

  • Untuk metode pengujian HPLC, biasanya mencakup 80 hingga 120 persen pengujian
    Konsentrasi analit dalam sample.
  • Untuk keseragaman kadar, meliputi minimal 70 sampai 130 persen dari tiap konsentrasi, berdasarkan sifat dari bentuk sediaan.
  • Untuk uji disolusi, ±20 % dari kisaran yang ditentukan (Q)
  • Untuk penentuan ketidakmurnian / impurity ditentukan dari tingkat ketidakmurnian hingga 120 % dari
    spesifikasi.

Dalam validasi metode uji HPLC, suatu metode dikonfirmasi ketika kriteria linearitas, akurasi dan presisi terpenuhi.

2.5. Accuracy/ Ketepatan

Keakuratan suatu metode analitik menunjukkan kedekatan nilai sebenarnya secara konvensional atau nilai referensi yang diterima dan nilai yang diperoleh dari validasi metode uji HPLC. Studi akurasi biasanya dilakukan dengan menentukan nilai recovery sampel analit yang telah dimasukkan ke dalam matriks sampel (plasebo) atau dengan membandingkan hasilnya dengan hasil bahan referensi bersertifikat kemurnian yang diketahui (USP reference standard).

Akurasi harus dinilai dengan menggunakan minimal sembilan preparasi sapel dengan minimal tiga tingkat konsentrasi yang mencakup kisaran tertentu (misalnya, tiga konsentrasi/ tiga ulangan masing-masing prosedur analitis total). Akurasi harus dilaporkan sebagai persen perolehan kembali/ recovery dengan penetapan jumlah analit tambahan yang diketahui konsentrasinya dalam sampel atau sebagai selisih antara rata-rata dan nilai sebenarnya yang diterima bersama dengan interval kepercayaan.

Konsentrasi harus mencakup rentang perhatian. Nilai perolehan kembali/ recovery yang diharapkan tergantung pada matriks sampel, prosedur pemrosesan sampel, dan konsentrasi analit.Batas akurasi yang dilaporkan untuk zat dan produk obat dengan metode uji HPLC adalah 98,0 – 102,0 % dan 97,0 – 103,0% masing-masing. Untuk penentuan ketidakmurnian/ impurity, berkisar antara 50 – 150 % dari pemulihan rata-rata dapat diterima .

2.6. LOD atau Batas Deteksi

Batas deteksi prosedur analitik secara HPLC dengan hasil analisis jumlah analit terendah dalam sampel yang dapat dideteksi tetapi belum tentu diukur sebagai nilai yang tepat. Batas deteksi dapat ditentukan dengan cara yang berbeda. Pendekatan paling sederhana didasarkan pada rasio signal to noise. Rasio sinyal terhadap noise ditentukan dengan membandingkan sinyal terukur dari sampel dengan konsentrasi analit rendah yang diketahui dari sampel kosong. Konsentrasi yang menunjukkan rasio sinyal terhadap noise antara 3:1 atau 2:1 pada umumnya dianggap sebagai batas deteksi yang dapat diterima. Pendekatan lain didasarkan pada standar deviasi dari respon dan kemiringan.

Deteksi batas/LOD dapat dinyatakan sebagai:

LOD = 3.3 x SD / Slope

Slope dapat diperoleh dari hasil uji kurva kalibrasi analit. SD dapat diperoleh sebagai standar deviasi blanko.

2.7. Batas Kuantisasi/LOQ

Batas Kuantisasi prosedur analitis individu adalah jumlah analit terendah dalam sampel yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang sesuai.

LOQ dipengaruhi oleh sensitivitas detektor dan akurasi persiapan sampel. Batas kuantitasi/LOQ dapat ditentukan dengan cara yang sama seperti batas deteksi/LOD. LOD merupakan hasil uji dengan metode HPLC dalam konsentrasi rendah tertenty yang menunjukkan rasio sinyal terhadap noise 10:1. Berdasarkan standar deviasi dari respon dan slope dapat dihitung dengan rumus:

LOQ = 10 x SD / Slope

LOQ juga dapat dibentuk dari evaluasi visual sebagai LOD. Konsentrasi analit harus dapat diukur dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima pada tingkat LOQ. Kriteria penerimaan untuk LOQ adalah recovery rata-rata pada tingkat hasil analisis antara 50 – 150 % dengan % RSD ≤ 25%.

2.8. Kekokohan/robustness

Kekokohan prosedur uji HPLC adalah ukuran kemampuan metode uji HPLC untuk tetap tidak terpengaruh oleh variasi kecil, tetapi disengaja dalam parameter metode dan memberikan indikasi keandalannya selama penggunaan normal. Ini sebagian dievaluasi selama tahap pengembangan metode. Tujuan dari studi robustness adalah untuk mengidentifikasi parameter uji kritis untuk implementasi dari metode uji yang berhasil dan tidak berpengaruh terhadap varians kecil. Dalam validasi metode HPLC, studi robustness melibatkan parameter metode seperti pH, laju alir, suhu kolom dan komposisi fase gerak yang bervariasi dalam kisaran yang wajar.

Parameter robustness seperti stabilitas larutan uji yang dibuat skematik dalam penyimpanan dalam jangka waktu yang lebih lama, mis. 4 jam, 12 jam, 24 jam, 48 jam, dll dalam suhu ruang maupun suhu sejuk/ kulkas. Kriteria penerimaan hasil uji stabilitas tersebut didasarkan pada perbedaan relatif antara nilai awal dan nilai stabilitas larutan yang ditentukan dalam waktu tersebut. Untuk zat aktif farmasi hasil awal dan akhir harus ≤ 2,0% dan untuk pengotor/ impurity harus ≤ 10%.2

2.9. Kesesuaian system/SST

Pengujian kesesuaian sistem (SST) merupakan bagian integral dari banyak prosedur analitis. Uji SST dalam HPLC berdasarkan konsep bahwa peralatan, operasi analitik, dan sampel merupakan bagian integral dari evaluasi kinerja HPLC. Dalam Uji kesesuaian system/SST memberikan jaminan bahwa metode UJI HPLC tersebut memberikan hasil yang akurat dan tepat. Uji kesesuaian sistem wajib dilaksanakan setiap kali awal melakukan analisis maupun saat analisis berlangsung.

Dalam hal metode HPLC, uji kesesuaian sistem memastikan kemampuan metode tersebut untuk dijalankan setiap hari. Parameter SST secara USP merupakan penentuan resolusi (Rs), pengulangan (% RSD dari respon puncak dan waktu retensi), kolom efisiensi/theoretical plates (N), dan faktor tailing (Tf). Parameter SST lainnya meliputi faktor retensi (k) dan faktor pemisahan (α). Persyaratan untuk parameter SST secara USP tercantum pada tabel 5.

Tabel 5 Batas Uji Kesesuaian Sistem

SST

Limits

Resolution (Rs)

>2.0

Repeatability (RSD)

<2.0% for five replicates

Plate count (N)

>2000

Tailing factor (Tf)

≤2.0

Separation factor (α)

>2.0

3.0. Kesimpulan Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi

Industri farmasi yang berkembang menuntut berbagai metode analisis untuk berbagai macam produk farmasi. Untuk memastikan kualitas produk, diperlukan analitis metode yang digunakan untuk memastikan kualitas harus memberikan hasil yang akurat dan dapat diprediksi. Untuk itu metodenya perlu divalidasi.

Metode HPLC adalah metode analisis yang disukai karena sifatnya currently, actual dan precise. Tinjauan ini memandu analis untuk memvalidasi metode kromatografi memenuhi persyaratan peraturan. Parameter yang sangat menentukan keberhasilan Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi yakni : SST, Linearity, specificity, accuracy, presisi, robustness, LOD dan LOQ.

Ditulis Oleh : CP

Sumber :

  • Instrumental methods of chemical analysis By B.K. Sharma (Pg:286-385)
  • Instrumental methods of Chemical Analysis By Gurudeep R Chathwal (Pg: 2.624-2.639)
  • Wael Abu Dayyih, METHOD Development and Validation of Vildagliptin and Metformin HCl in Pharmaceutical Dosage form by Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC)

Demikian pembahasan tentang “Validasi Metode HPLC Untuk Analisis Farmasi“. Bagi anda yang membutuhkan diskusi cepat produk ini bisa menghubungi contact PT. Andaru Persada Mandiri via whatsapp 087777277740 atau telepon 0251-7504679. Link alamat kami sertakan pada Google Maps.

One Comment

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *

error: Konten dalam website ini memiliki hak cipta, verifikasi untuk izin penggunaan.
WhatsApp chat